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人芳香酶的多态性影响蛋白质动力学和底物结合:光谱证据

抽象的

人芳香酶是细胞色素P450超家族的成员,参与类固醇激素生物合成。特别是,它将雄激素转化为雌激素,因此负责正确的性类固醇平衡。由于其生产雌激素的产能,它也被认为是乳腺癌治疗的有希望的靶标。已经显示出两种单核苷酸多态性(R264C和R264H)改变芳族酶活性,并且它们与雌激素依赖性病理学的增加或降低的风险相关。这里,通过UV / FTIR和时间分辨的荧光光谱研究了这些突变对蛋白质动力学对蛋白质动态的影响。通过FTIR为三元蛋白质中的三种蛋白质的FTIR测量H / D汇率,并且数据表明野生型酶经历构象变化,导致基材或基材上的更紧凑的三级结构抑制剂结合。实际上,当存在配体时,H / D汇率降低。在变型中,无配体和 - 基因形式中的汇率是相似的,表明缺乏结构变化,尽管单一氨基酸取代位于蛋白质分子的外周壳中。此外,荧光寿命数据表明,在两个变体中,不存在于在野生型中观察到在野生型中的配体结合时对色氨酸-224的猝灭作用。 Since this residue is located in the catalytic pocket, these findings suggest that substrate entrance and/or retention in the active site is partially compromised in both mutants. A contact network analysis demonstrates that the protein structure is organized in two main clusters, whose connectivity is altered by ligand binding, especially in correspondence of helix-G, where the amino acid substitutions occur. Our findings demonstrate that SNPs resulting in mutations on aromatase surface modify the protein flexibility that is required for substrate binding and catalysis. The cluster analysis provides a rationale for such effect, suggesting helix G as a possible target for aromatase inhibition.

背景

结构柔韧性是蛋白质的关键性质,因为它允许大多数生物功能所需的分子重排。Such rearrangements include large conformational changes (i.e. those characterizing cargo and contractile proteins), long distance displacements (for instance, those occurring in some integral membrane receptors), or even smaller, local conformational changes (as those required for the action of most enzymes). Flexibility allows substrates binding, products release and it is needed to confer allosteric properties to enzymes that control and regulate metabolic pathways and cells growth. Cytochromes P450 are a very good example of such enzymes as they are heme-containing monooxygenases involved in key metabolic pathways and xenobiotic detoxification. Moreover, they are known to undergo conformational changes to allow substrate access, catalysis and product release [1946伟德国际官网 ]。特别是,结构数据表明,一些元素,如F-和G-螺旋和连接它们的环(F-G环)是高度灵活的,可以打开和关闭连接蛋白质表面和活性位点的通道[1946伟德国际官网 1946伟德国际官网 ]。

人类细胞色素P450具有高度多态性,一些单核苷酸多态性(SNPs)已知通过降低催化效率来影响酶的活性。虽然许多SNPs的影响可以通过蛋白质结构中突变的位置来合理化,但对于其他的则很难预测。这是存在于人类芳香化酶中的两个snp的情况,芳香化酶是一种细胞色素P450,在类固醇生成中起关键作用,因为它催化雄激素转化为雌激素[1946伟德国际官网 ]。这种蛋白质的正确活性至关重要,因为雌激素和雌激素之间的平衡的变化,雌激素的均衡或超生成雌激素与一系列疾病相关,这些疾病范围从神经疾病到乳腺癌[1946伟德国际官网 ]。我们之前的特征在于普通的R264C(RS700519)和RARER R264H(RS2304462)多态性变体,显示这些变体的活性通过动力学参数的改变来修改[1946伟德国际官网 1946伟德国际官网 通过不同的磷酸化倾向,因为R264是磷酸化共有序列的一部分[1946伟德国际官网 ]。然而,这种残留物在于蛋白质表面,是G-Helix的一部分,因此难以理解其突变的突变仅基于该位置的突变。

我们之前表现出芳香酶需要动态灵活性来绑定和处理其基材[1946伟德国际官网 ]。在本文中,我们使用了实验技术(即红外和荧光光谱)的组合来评价单点突变(R264C或R264H)对人芳香酶的外表面上的影响,其具有其遍布结构和其生物学功能。与这种实验方法平行,也已经进行了蛋白质结构的接触网络分析。在过去的几十年中,将这种计算方法应用于蛋白质的应用已经允许从新的角度来看这些复杂的分子,因为这种种类的算法使用少数描述符来表征氨基酸之间的空间间连接。以这种方式,残留簇在蛋白质阶段结构和远程相互作用内定位,可以预测协作效应和节段性迁移率。该方法跨度从蛋白质 - 蛋白质相互作用的应用[1946伟德国际官网 1946伟德国际官网 ]对酶的构建调节[1946伟德国际官网 1946伟德国际官网 ],在最近的研究中允许推测可能对退行性疾病的药物的可能结合位点[1946伟德国际官网 或病毒[1946伟德国际官网 ]。我们证明这种方法与实验数据的组合可能表明对R264C和R264H变体中观察到的生物活性丧失的分子解释。

结果

H / D兑换后跟FTIR

傅里叶变换红外光谱(FTIR)被应用于确定重组人芳香酶(ARO)及其多态性变体中H / D交换的动力学,以检测由配体结合诱导的蛋白质构象变化产生的氘化学动力学的可能差异。数字1946伟德国际官网 显示在典型的H / D Exchange动力学实验的开始和结束时记录的FTIR光谱,在无基质ARO的情况下。

图。1
图1

APO-ARO的FTIR光谱在开始(蓝色)和纵向动力学的末端(红色)。在插图(右侧)在氘地上增加吸收强度,在λ= 1460cm- 1在1650厘米处的光谱归一化后显示(红色箭头)- 1

1670厘米之间的带- 1和1620厘米- 1已被分配给酰胺I,而1470厘米之间的频段- 1和1420厘米- 1已归因于酰胺II。因此,H / D汇款随着1460厘米的酰胺II带的吸光度的增加而增加- 1(图。1946伟德国际官网 (插入),时间范围为160分钟。

经质子的级数交换的时间依赖性显示出前十分钟的显着增加,而在接下来的2-3h中发生了更慢的动力学(图。1946伟德国际官网 ).事实上,数据最能适用于双指数曲线(CFR。方法),其产生两个不同的速率值(表1946伟德国际官网 ).ARO WT样本的特点是初始过渡速度更快(k1≈0.4米- 1),通过配体结合显着减慢的过程(图。1946伟德国际官网 ,小组a),k1在底物和抑制剂分子的存在下,值降低到一半(表1946伟德国际官网 ).在长期组件中没有观察到显着差异(k2),表明动力学的较慢部分与结合过程无关。在H / D Exchange动力学中,与ARO WT不同,底物和rostenione和抑制剂Anastrozole在多态变体上的存在不相关(图。1946伟德国际官网 b,c)。特别地,原始数据的特征在于过程的初始部分的速度较慢(T≈0-20min,1946伟德国际官网 ),其拟合产生较低的速率常数(k1 ≈ 0.2 min- 1, 桌子1946伟德国际官网 )关于WT蛋白质的蛋白质。同样,在两个突变体中引入androstenione或Anstrozole不影响动力学的第二步骤(图。1946伟德国际官网 而且,实际上,在第二速率恒定值中没有观察到显着变化(k2≈0.016分钟- 1, 桌子1946伟德国际官网 ).

图2
图2.

H / D兑换的动力学,然后是WT-ARO的FTIR(面板一种,蓝色符号)和两种多态性变体(即R264H,面板B.,和r264c,面板C,蓝色符号)。还报道了存在于底物和rostenione(绿色符号)和抑制剂Anastrozole(红色符号)的存在中的动力学。实线对应于最佳双指数拟合曲线,其参数在表中报告1946伟德国际官网

表1对图1中报告的数据执行的双指数配合的结果。1946伟德国际官网

存在复杂的动力学(表1946伟德国际官网 )表示质子群体中的异质性。实际上,蛋白质中H / D换算过程的双相行为通常就是两组肽氢,一种溶剂分子可获得(并受到更高的交换率)和所在的第二组在更掩埋的蛋白质区段中,水较少可供水[1516171946伟德国际官网 ]。由于蛋白质表面的H/D交换过程太快而无法检测,因此必须将两个速率常数指定为部分暴露(k1)或埋葬(k2)残留质子。在这种情况下,一个相关的意义可以归因于前指数因子m一世相应的拟合,因为它们代表每个质子群的初始级分(即时= 0)。如表所示1946伟德国际官网 , 他们1在没有任何配体的情况下,WT蛋白的值是最高的(≈0.060),并且当存在一个配体时,最低(≈0.20),从而表明大变化Δm1 ≈ − 65%, occurs in the population of the partially exposed protons upon binding.

相反,在两个突变体的情况下,观察到的下降结果更小(Δm1 ≈ − 40% for R264H and Δm1对于R264C,≈23%),表明配体结合引起的结构效应不那么明显。

内在荧光动力学

通过相移和解调技术表征了芳族酶的固定荧光酶的内在荧光的变化,并且数据分析结果如图2所示。1946伟德国际官网 .如前所述[1946伟德国际官网 [蛋白质排放衰减是非常异质的,其特征在于四个不同的寿命组分,从十分之一到6-9 ns。这种复杂性是由于存在五种色氨酸残留物,位于蛋白质支架的不同环境中。WT样品在存在底物或抑制剂存在下的主要特征是在≈5ns的分数贡献的大幅度降低(图。1946伟德国际官网 一种)。这种相当大的猝灭效应已经归因于先前的荧光测量到基材和特定色氨酸残基之间的相互作用,即W224,其埋在蛋白质基质的核心[1946伟德国际官网 ]。

图3.
图3.

WT-ARO荧光衰减的寿命组件(面板一种), R264H(面板B.)和R264C(面板C)在缺失(虚线)和存在底物(绿色)或抑制剂(红色)

如图1所示。1946伟德国际官网 B和C,在R264H和R264C的5ns的分数贡献中没有在配体添加时检测到变化,表明在突变体中,底物或抑制剂分子的结合在W224的环境中不会产生显着的影响,提示关于WT腔的不同局部构象。

通过研究蛋白质旋转动力学进一步测试了该假设。实际上,长寿命组分的存在允许使用芳香酶内在荧光进行各向异性测量。在图2中报告了相应的相移和解调数据。1946伟德国际官网 ,对于Aro wt和R264C或R264H突变体。结果表明,两种突变形式显示较慢的旋转动力学,相对于wt蛋白,数据被转移到一个较低的频率范围。

图4.
图4.

WT-ARO(圆圈),R264H(正方形)和R264C(三角形)的相移(黑色符号)和解调数据(紫色符号)。实线对应于使用两个旋转相关​​时间获得的最佳拟合

实际上,在wt、R264H和R264C情况下,各芳香化酶类型的相位曲线和解调曲线在≈150 MHz、63 MHz和93 MHz处相互交叉,说明R264H是动力学最慢的形式。图中所示的相移和解调点的非线性拟合。1946伟德国际官网 结果如图所示。1946伟德国际官网 .每个数据集都需要两个旋转相关​​时间,φ1,和φ.2.第一个,φ1,从21 ns(wt)至33 ns(r264h)的范围,它与整个蛋白质的旋转运动相容,如图2的左侧绘制的卡通所示。1946伟德国际官网 .实际上,预测的转动具有相同芳ompatase(≈58,000)的球形水合分子的主要轴线将是φsph ≈ 24 ns [1946伟德国际官网 ]。更长的φ.1表征R264C和R264H表征的值,表明了一种更膨胀的三维形式,因为扩展的三级结构会产生较慢的运动。

图5.
图5.

long(φ.1短(φ2)APO-WT和APO-突变体(蓝色)芳香酶的荧光相关寿命。φ的值1和ϕ2在添加底物或抑制剂后,分别以绿色和红色报告。在漫画中,报道了芳香酶的色带模型,其中R264和五种色氨酸的位置在绿色和粉红色VDW球体中突出显示

在WT样品的情况下,蛋白质结合腔中的基材(或抑制剂)的入口在φ中产生了相当大的减少1值(≈ - 〜23%,图。1946伟德国际官网 )因此暗示了更快的旋转动力学。这种趋势也以突变的形式观察,但有两个重要差异:i)φ的相对变化的程度1不那么明显(≈−11%和−15%);Ii)两个样本中的ϕ1无论使用的配体(底物或抑制剂)是什么,值都保持在23 ns以上。1946伟德国际官网 ).

第二旋转寿命,φ2,在WT和R264C芳香酶的情况下,在WT和R264C芳香酶的情况下≈000-500ps的顺序要短得多,关于R264h(图。1946伟德国际官网 ).这些值反映了更快的动态(相对于ϕ1),可以归因于色氨酸环境的平均局部运动。结合口袋中的配体的存在在WT和R264C样品的情况下减慢这种运动,基底分子是最有效的,因为φ2几乎是全息形式的两倍(图。1946伟德国际官网 ).相反,添加底物或抑制剂不会产生r264h的局部动态的显着变化,如φ的相似性所示2价值。

ans绑定

8-苯基-1-萘磺酸(ANS)是一种疏水探针,其在结合到表面腔和蛋白质的袋中时增加其荧光强度[1946伟德国际官网 ]。因此,研究改变蛋白质三维结构致密性的构象变化,例如由温度引起的构象变化是特别合适的[1946伟德国际官网 ],pH [1946伟德国际官网 ], 压力 [1946伟德国际官网 ]和底物结合[1946伟德国际官网 ]。为了表征芳族酶的活性位点在多大程度上,芳族酶的活性位点改变蛋白质表面的粗糙度和可达性,我们将含量的含量含量增加给含配体的样品并比较了相应的滴定曲线和适合图。1946伟德国际官网 .如各自的解离常数(报告在表中1946伟德国际官网 ),WT蛋白对ANS显示出较低的亲和力,其KD.值是R264H的3倍,R264C的2倍1946伟德国际官网 ).有趣的是,在所有样品中,ans结合过程不依赖于所用的配体,给予基材和抑制剂的相同结果(图。1946伟德国际官网 和表1946伟德国际官网 ).

图6.
图6.

在饱和浓度(绿色)或抑制剂(红色)存在下,WT-ARO(圆圈)和突变体R264H(正方形)或R264C(三角形)的αS结合曲线。所有蛋白质的浓度为6.4μm。实线对应于通过Chi平方最小化程序对每个样品获得的最佳拟合(参见材料和方法)

表2由图2中报道的配合产生的芳族酸酶解离常数。1946伟德国际官网

联系网络分析

已经尝试使用含基质芳香酶(PDB代码4KQ8)的可用晶体模型的喹臭酶结构的拓扑表征,以及通过分子动力学模拟获得的硅酸盐蛋白质的硅形式的硅藻版[1946伟德国际官网 ]。联系网络方法包括粗晶算法,将蛋白质的氨基酸降低到三维栅格的“节点”中,鉴定了每种残余物的位置与其α-碳的位置。每对氨基酸距离比评估,并构建(n×n)矩阵,构成为“1”和“0”元件,对应于网络的相互作用或非交互元件(根据辨别距离,固定a先验)。最终,由于基于其相互相互作用的数量,将节点组的聚类程序识别出“模块”。在芳族酶的情况下,这种分析允许鉴定蛋白质的两个不同区域,如图2所示。1946伟德国际官网 左侧面板,其中晶体结构的每个模块分别用不同的颜色,红色和绿色突出显示。

图7.
图7.

在图的左侧,报告了在应用于4KQ8 PDB文件的联系网络分析的基础上识别的两个簇(红色和绿色)(HEME组也以蓝色显示)。G-Helix已被一个红点云突出显示。在右侧,与残留物R264(蓝色,VDW)和那些形成底物Androstentione的接入通道(根据SGRIGNANI和Magistrato,2012)和血红素组()的氨基酸(紫色,VDW)以及相同的结构。(红色的)。两张图片中的黑线标记了两个集群的边缘

聚类应用程序不会导致明显的域分区(例如具有特异性生物活性特征的次要结构的次要结构或区域的区域的区域,也不是序列的两个不同部分中的两个簇部分。两个簇中的每一个的空间分布是均匀的,并且边界可以通过垂直于血红素组的平面来近似。如图1所示。1946伟德国际官网 rigth面板,这样的抽象平面位于基材使用的通道下方,以到达催化部位[1946伟德国际官网 表示两簇之间的边界是蛋白质生物学功能的关键区域。可以更定量地描述该特征评估所谓的“参与系数”,p,反映一个群集中包含的每个节点的趋势以与属于另一个组的节点建立连接的参数[1946伟德国际官网 ]。该连通性指数的取值范围为0 ~ 1。1946伟德国际官网 a)和平均蛋白值,

,在整个序列上计算,结果是

≈0.076(图。1946伟德国际官网 b)。更高P.值表征,而是位于集群边界的残差,包括形成Helix G的中心部分的那些(虚线矩形。1946伟德国际官网 b).在底物结合芳香化酶模型的情况下,也评估了参与系数,P某人, holo-和apo-形式之间的差,ΔP = P某人- P,在图1中表示。1946伟德国际官网 C。

图8.
图8.

在小组中一种根据其数值在左侧报告的颜色代码,示出了WT-ARO的每种氨基酸的参与系数P.在小组中B.分布的P.值表示为序列位置(x轴)和属于图中确定的两个簇之一(红色或绿色)的函数。1946伟德国际官网

是蛋白质平均参与系数。虚线矩形的区域对应于G-Helix残基。在小组中C差异Δp= p某人- 报告了HOLO和APO形式的P值之间的p。绿色已归因于那些在配体绑定时P值不会改变的残留物(ΔP= 0)

虽然大多数蛋白质残留物不受配体结合过程的影响,但拓扑分析表明,在形成结合通道的那些残留物的情况下发生参与系数的显着增加(图。1946伟德国际官网 c).螺旋G的中心部分则表现出相反的效果,P值下降幅度最大,说明配体的存在降低了该区域在开放、无配体蛋白形式下的连接作用。

讨论

人类蛋白质的多态性是一种众所周知的现象[1946伟德国际官网 ]最近在科学界提出了很大的兴趣,因为癌症预测性研究(基于酶变异分析)有精确药物[1946伟德国际官网 ]。通过新算法对蛋白质变异数据库进行系统研究[1946伟德国际官网 1946伟德国际官网 ]显着提高了癌症生存预测的准确性[1946伟德国际官网 31.32.1946伟德国际官网 ],就药物引起的损害提供了见解[1946伟德国际官网 ]并允许识别新的,有前途的生物标志物[1946伟德国际官网 ]。在该一般框架中,芳香酶多态性的结构和功能表征尤为重要,因为该酶被认为是乳腺癌治疗的潜在靶标[1946伟德国际官网 ]。

胎盘的晶体结构[1946伟德国际官网 重组[1946伟德国际官网 芳族酶已经证明,蛋白质具有紧凑,球状折叠,并且R264局部地局部地偏离底物结合位点。尽管存在这种外围位置,但已知arg转化为他或Cys或Cys影响蛋白质功能性,降低其结合基材的能力并降低其催化效率[1946伟德国际官网 ]。圆二色光谱显示,这两个多态变异体保留了wt的二级结构,但热稳定性较低,这表明突变可能改变了R264所归属的螺旋G的运动[1946伟德国际官网 ]。细菌P450的结构研究和分子动力学模拟已经揭示了这种α螺旋,通过相邻的螺旋F,在通道的开口中,其提供基板的访问到活性位点[1946伟德国际官网 1946伟德国际官网 1946伟德国际官网 ]。

本研究报告的联系网络分析已确定两个主要簇(图。1946伟德国际官网 ),它们通过主要沿着允许底物进入活性位点的通道错位的残基进行“通信”。这样的拓扑分析表明,芳香化酶的底物结合过程发生了巨大的构象变化,包括两个模块之间的长期相互作用。螺旋F和螺旋G也不例外:它们的中心部分包含了连接两个簇的关键节点的相关数量。1946伟德国际官网 a和b)并且经历参与系数p的最大(阴性)变化p,因为蛋白质结合底物分子(图。1946伟德国际官网 C)。ARO WT中的H / D Exchange的动力学(图。1946伟德国际官网 一个和表格1946伟德国际官网 )表明,在雄烯二酮和阿那曲唑存在的情况下,这些构象变化使更多暴露的质子的比例大大减少。荧光各向异性测量似乎排除了一些简单的解释(如配体的筛选效应),这些解释说明了在配体结合的形式中,蛋白质如何通过构象变化获得更紧凑的三级结构,从而赋予分子更快的旋转动力学(图)。1946伟德国际官网 ).为两种多晶型变体获得的结果表明,这些样品在H / D动力学中经历了更小的变化(表1946伟德国际官网 在长旋转相关时间(图。1946伟德国际官网 ).更重要的是,在两种配体存在的情况下,它们相对Aro wt保持了更高的ANS结合能力(图和表)1946伟德国际官网 ),证实了它们缺乏配体结合Aro wt的致密性。因此,底物(或抑制剂)分子正确进入蛋白质活性位点受到损害,这是动态荧光测量所证明的。事实上,在之前的一项研究中[1946伟德国际官网 [我们已经证明,4.5-5.0ns的寿命组分可归因于W224,因为它不存在于突变体中,例如W224F [1946伟德国际官网 ]。由于这个色氨酸位于芳香化酶结合位点附近,它被雄烯二酮或阿那曲唑的进入戏剧性地猝灭(图。1946伟德国际官网 a),可用于监测活性位点的特定区域中的配体诱导的结构变化。在两种多晶型变体中没有这种特定荧光寿命组分的任何显着差异(图。1946伟德国际官网 B,c)表明,在螺旋G的末端引入R264的终点局部扰动损害了配体在活性位点的正确放置,从而为突变体的减少的活性提供了结构基本理由[1946伟德国际官网 ]。

芳香酶的正常模式分析[1946伟德国际官网 [蛋白质表明蛋白质显示出非常刚性的芯(大约对应于血红素组),其被逐渐柔性区域的同心壳包围。螺旋f和g及其连接环是这样的外部移动结构区域之一[1946伟德国际官网 ]。事实上,与螺旋G的灵活性有关的长程效应已经在细菌细胞色素P450的案例中报道过了[1946伟德国际官网 ]。研究表明,涉及ASP 251的盐桥的断裂对配体的识别和结合具有重要的影响。

根据本研究报道的接触网络分析,该蛋白可以被描绘成一种三明治,其中央切片对应底物通道(Figs。1946伟德国际官网 1946伟德国际官网 ).在这张照片中,夹心的包装将由由螺旋F和G施加的夹紧的夹紧机构控制,其铰链机构位于其高度连接的中心元件中(图。1946伟德国际官网 ).The substitution of R264 with residues characterized by a different geometry (HIS and CYS), length and charge (CYS) must severely affect the salt bridge interaction with ASP 251, altering the “pivot” mechanism by which the flexible F-G group controls the interconnection between the two clusters.

结论

总之,本研究报告的数据通过两种独立的光谱技术证明了人芳香酸酯酶在配体结合时具有更紧凑的遍倍致力化构象。相反,突变体R264C和R264H(损害底物和抑制剂分子的正确结合)经历较低的填充过程,表明其移动段的轻微灵活性。由于对蛋白质结构的接触网络分析,可以设想对这种行为的理由,这揭示了螺旋f和g在形成基板通道的两个簇之间的连接作用,该螺旋f和g在形成衬底通道到有源部位。因此,基于体外测量,这样的解释揭示了两种多态性在生物中的分子影响

方法

材料

重组人芳族糖酶被表达大肠杆菌并如前所述纯化[1946伟德国际官网 1946伟德国际官网 ]。用相同类型的缓冲液纯化野生型和突变体,即100mM磷酸盐缓冲液pH7.4含有20%甘油,1mMβ-巯基乙醇,0.1%Tween-20。

用于蛋白质纯化的所有化学物质购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,莫美国),并分析等级。

所有荧光实验的蛋白质(WT和突变体)浓度为约6.5μm,而如果存在,则分别存在,Androstentione和Anstrozole浓度分别为20μm和10μm。

H / D Exchange Kinetics实验通过ATR-FTIR

H / D汇款的动力学之后是DI Nardo等人报告的FTIR。[1946伟德国际官网 ]。使用红外分光光度计Bruker Model Tensor 27(Bruker Instruments,USA)在室温下进行实验,其与衰减的总反射率(ATR)采样工具(哈里克科学产品,USA)相结合。工作参数设置如下:扫描速度10 kHz;分辨率4厘米- 1;光谱采集频率限制4000和800厘米- 1.通过直接在ATR锗晶体上沉积薄蛋白质膜(30μl,50μm)来分析蛋白质样品。特别地,通过将​​酶与亚甾酮作为β或Anastrozole作为抑制剂一起孵育酶,以配体自由形式和配体染色形式分析ARO。通过UV / Vis光谱通过监测抗甾醇精英418nm至394nm的最大吸收率的偏移和为Anastrozole的418nm至422nm的最大吸光度的偏移来检查底物和抑制剂对ARO的活性位点的正确结合。在采集期间,分光光度计样品室与D连续吹扫2富含氮。将光谱以1分钟的间隔收集,前10分钟,每8分钟为下列160分钟。对于每次,每次收集60次扫描并平均。光谱至少以四份催化和平均在每次点平均,通过蛋白质储存缓冲液表示的对照样品的贡献,并标准化。通过遵循约1460厘米的吸光度增加来研究H / D Exchange动力学- 1,对应于粉丝酰胺II带的偏移。绘制相对吸光度值作为时间的函数,适用于双指数函数,并使用Sigmaplot软件计算和比较氘速率。

荧光测量

使用K2-ISS(ISS,Inc.,Champaign,IL,USA)使用外部浴室循环器使用K2-ISS(ISS,Inc.,Champaign,IL,USA)的荧光荧光仪收集荧光光谱。研究使用350nm的激发波长测量从450至550nm的探针测量荧光发射光谱的结合。所有光谱都被空白减法校正。

假设简单的结合平衡,即Ans + P = ANS-P,并拟合总荧光F,在增加ANS,[ANS]的情况下,分析了8-苯基-1-萘磺酸(ANS)结合曲线。至:

$$ \ mathrm {f} = {\ mathrm {f}} _ {\ idty} \ left(\ left [\ mathrm {ans} \ revally] + {\ mathrm {p}} _ 0 + {\ mathrm {k}}} _ {\ mathrm {d}} \右) - \ sqrt {{\ left(\ left [\ mathrm {ans} \ light] + {\ mathrm {p}} _ 0 + {\ mathrm {k}} _{\ mathrm {d}} \右)} ^ 2-4 \ left [\ mathrm {ans} \ led] {\ mathrm {v}} _ 0} \ lex)/ left(2 \ {\ mathrm {p}} _0 \右)$$

哪里p.0.是总芳香酶浓度和kD.该过程的解离常数。

使用Koala-ISS荧光计的相移和解调技术进行寿命和动态荧光各向异性。激发源是300nm激光二极管,通过WG320-NM截止滤波器收集发射以避免散射。通过Glan-Thompson偏振器收集各向异性衰减,考虑到G型校正。使用一组至少30频率重复所有测量以三次重复以获得良好的统计数据。通过ISS提供的软件分析了数据。

联系网络分析

蛋白质联系网络(PCNS)依赖于对蛋白质结构的极简主义观点,视为残留物之间的有源触点网络(网络节点是蛋白质残留物,并且对残留物之间的有源触点是网络链路)。主动触点的定义对于定义从网络分析中出现的性质是至关重要的。在这项工作中,我们定义了对应于4到8的残留物之间的距离的任何接触。这种选择仅包括对环境提示的重要非共价键。从残留物的坐标开始计算残留物之间的距离α.-Carbons。

pcn的数学描述由邻接矩阵提供,定义为:

$$ {a} _ {ij} = \ big \ {{\ displaystyle \ begin {array} {cc} 1&if4 \ surnet {o} {a} <{d} _ {ij} <{d} _ {ij} <8 \ surnes {o}{a} \\ {} 0&否则\ end {array}} \ OperatorName {} $$

一旦建立了网络,就可以派生几个网络描述符。最重要和简单的是节点度K.一世, 定义为:

$$ {k} _i = {\ sum} _j {a} _ {ij} $$

基于节点度,我们将频谱聚类算法应用于分区PCN到集群中。我们将该方法应用于网络拉普拉斯人,定义如下:

$$ \ boldsymbol {l} = \ boldsymbol {d} - \ boldsymbol {a} $$

A是邻接矩阵,D是次矩阵,即一个对角矩阵,其对角线是次向量。将特征值分解应用于拉普拉斯算子L:特征值v2的第二子矩阵对应的特征向量对于聚类划分是有意义的。以划分为两个簇为例,根据向量v2对应分量的符号将节点划分为两个簇。

分区是二进制和分层的;群集数(2的功率为2)是输入值。

在这项工作中,我们将结构分为两个集群,因此我们只应用了一旦将光谱聚类算法应用于PCN。

一旦应用了网络群集,就可以导出群集描述符,参与系数pi,用于第i个残差(节点)定义为:

$ $ {P} _i = 1 -{\离开(\压裂{k_ {si}} {k_i} \右)}$ $ ^ 2

K.SI.I节点度是否只包括属于同一集群的节点的链接K.一世节点是I度。因此,P解决了节点在不同集群(pcn中的域)之间的信号传输中的作用。

可用性数据和材料

不适用。

缩写

SNPS:

单核苷酸多态性

Aro:

重组人芳族芳香酶

FTIR:

傅里叶变换红外光谱

ATR:

减弱总反射率

ANS:

8-Anilino-1-naphthalenesulfonic酸

PCN:

蛋白质接触网络

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致谢

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资金

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作者信息

从属关系

作者

贡献

G.D.N.和a.d.v .:设计实验,解释了数据并促成了稿件写作;C.Z.:促进突变体,纯化和表征野生型和突变体;E.N .:设计,表演和解释的荧光实验;C.S.S:设计,执行和解释FT / IR实验;L.D.P:设计,执行和解释联系网络分析并促成了稿件写作;G. G和G.M:设计了研究项目,设计了实验,解释了数据并促成了稿件写作。作者阅读并批准了最终手稿。

作者的信息

不适用。

相应的作者

对应于Gianfranco Gilardi.Giampiero Mei.

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不适用。

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张国栋,张国栋,张国栋,张国栋。等等。人芳族糖酶的多态性影响蛋白质动力学和底物结合:光谱证据。Biol Direct.16,8(2021)。https://doi.org/10.1186/s13062-021-00292-9

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关键词

  • 芳香酶多态性
  • 配体绑定
  • 荧光
  • 分子造型