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pannexin1基因敲除小鼠导管动脉内皮功能受损

摘要

Pannexin1在脊椎动物组织中广泛表达,但其在血管张力调节中的作用尚不清楚。我们发现Pannexin1在隐动脉平滑肌内皮中的表达水平高于隐动脉平滑肌。在基因消融Pannexin1的小鼠中,内皮完好的动脉扩张能力明显受损,而收缩反应显著增加。内皮剥去的动脉中未检测到这种增加的收缩反应。综上所述,我们的研究结果表明Pannexin1在正常的内皮依赖性动脉张力调节中起着重要的作用,它促进血管扩张并减轻收缩。

由Armen Mulkidjanian博士和Alexander Lobkovsky博士审阅。

发现

介绍

细胞对细胞通信提供多细胞生物中细胞过程的协调。在血管系统中,多层通信在不同类型的细胞之间进行[1]。这种基本通信的所知的机制包括间隙结(GJ)[1,2]和信号分子的旁分泌作用,如ATP [3.]。GJ是由连接蛋白家族的蛋白质组成,连接相邻细胞的细胞质形成一个跨膜通道,可渗透到离子和小分子。连接蛋白,近30年前被鉴定为GJ的分子成分[2,只在脊索动物中发现[4,5]。在无脊椎动物中发现不同的功能相似但结构性无关的GJ蛋白质。这个特定的无脊椎动物GJ蛋白质最初指定了Opus [6]后来更名为innexins [7]。在人类和其他脊椎动物中发现innexin同源物后,有人提议将它们和脊椎动物的同源物一起重新分类,形成一个更大的家族,命名为pannexins [8,9]。哺乳动物Pannexins有三个家庭成员(Panx1,2和3),参与GJ形成[10,12/或形成血小晶,其涉及从细胞质从细胞质释放到细胞外的Milieu中的ATP和其他小分子。一些调查人员声称,脊椎动物Pannexins仅在体内形成血管箱[13,14]。因为pannexins参与了细胞间通讯,而细胞间通讯对血管系统的功能至关重要[1]时,pannexins的存在(或缺失)将影响血流调节。

血管壁的两个主要功能成分是平滑的肌肉和内皮。内皮介质许多血液循环激素和局部作用自动腐蚀剂的血管扩张效果[15]。此外,内皮可以强直地抑制血管收缩,即使没有直接激活;内皮效应被认为是内皮的一种抗收缩效应的现象[16,17]。值得注意的是,阻力大小和较大导管动脉的内皮功能受损被认为是许多心血管疾病的主要原因[18]。

在鼠系统性动脉网络中PANX1是主要表达的同种型[19]。Panx1在所有动脉的内皮中丰富[19]和毛细血管[5]但是Panx1表达的模式取决于血管尺寸。与较大的导管动脉相比,Panx1主要在内皮中表达,在较小的抵抗动脉中,它也表达在平滑肌细胞中[19]。已经证明Panx1是ATP释放的重要途径,从而增强骨骼肌收缩[20.]。相似的是,在小动脉平滑肌中,panx1介导的ATP释放通过增强动脉对α的收缩反应参与血管张力调节1-Adrenoceptor激活[21]。然而,Panx1在促进血管舒张和内皮抗收缩作用中的功能作用尚未被研究。

本研究首次提出了Panx1在血管扩张机制内皮依赖成分中发挥关键作用的证据。由于目前没有Panx1通道的真正选择性药物阻滞剂,我们使用Panx1−−/将Panx1作为研究Panx1活性在血管系统调节中的功能意义的最终实验模型。

结果与讨论

Lohman等人。[19]使用免疫组化技术主要揭示了Panx1在小鼠全身导管动脉中的内皮定位。然而,由于大多数针对该蛋白的抗体的特异性较差[22], Panx1的定量免疫组化数据仍然相当不可靠。在这里,我们通过另一种更定量的方法解决了这个问题,即通过比较内皮完整和内皮剥去动脉准备中Panx1基因的表达水平(图)1一个;额外的文件1:图S1)。与预期的一样,内皮细胞的破坏导致内皮标记物CD31的转录量显著减少。因此,去除内皮后Panx1转录本显著下降,表明Panx1主要在小鼠隐动脉内皮细胞中表达。在Panx1的隐动脉中−−/用相同引物进行PCR扩增,未检测到Panx1转录本。

图1
图1

Panx1隐动脉内皮功能受损−−/老鼠。(一)内皮完整组CD31/SM22和Panx1/SM22 mRNA相对表达水平(+ Endo)和剥去内皮(−Endo)WT小鼠的动脉(n = 4; 4,CD31和n = 3; 4用于PANX1; * P <0.05,)。数据被归一化为平滑肌细胞标记SM22 mRNA的量,并表示为相应内皮完整的平均水平的百分比(+ Endo)组。(B)浓度 - 响应关系与累积添加α1- 中肾上腺素in激动剂去氧肾上腺素内皮剥蚀(薄曲线;N = 11, 10, p = 0.14)或endothelium-intact(厚曲线;n = 22、24,*p < 0.05)−−/老鼠。(C)浓度 - 响应关系endothelium-intact隐动脉从WT和Panx1−−/小鼠对KCl (n = 6;9、*p < 0.05;1 μmol/L酚妥拉明阻断交感神经释放去甲肾上腺素的作用)。(d)苯肾上腺素诱导的乙酰胆碱预构建后的浓度反应关系endothelium-intact隐动脉从WT和Panx1−−/小鼠(n = 6,6,* p <0.05)。

啮齿动物神经动脉中的血管间调主要由释放去甲肾上腺素的交感神经来调节,这主要通过α使血管收缩1-adrenoceptors。为了模拟去甲肾上腺素的收缩效应,我们检测了对α的收缩反应1- 肾上腺素能激动剂吩妥和内皮在WT和PANX1中内皮的调节作用−−/老鼠。α.1-Adrenoceptors仅位于平滑肌细胞上,不在内皮上;因此,苯妥芒刺激主要是平滑的肌肉。苯妥林诱导的收缩响应内皮剥蚀动脉在WT和Panx1中没有差异−−/老鼠(图1b),其与鼠隐脊动脉面纱的主要内皮定位有关(图1一个)。

在wt小鼠中,endothelium-intact动脉对苯肾上腺素的敏感性低于内皮剥去的动脉(图)1B,由于内皮的抗收缩作用[16,17]。重要的是,Panx1对动脉内皮的这种影响−−/明显弱于WT小鼠。这与Panx1介导且Panx1消融减弱内皮抗收缩作用的模型一致。如图1B表示苯肾上腺素浓度为2*10时-7M (point−6.7)在KO小鼠中的反应是WT小鼠的两倍以上。定量地说,Panx1的活性约占内皮抗收缩作用的一半。

值得注意的是,通过类似于天然变送器,去甲肾上腺素的胰腺交感神经可以占用。因此,WT和PANX1之间观察到的差异−−/老鼠(图1b)可以通过改变的神经元摄取来解释,如血管去除模型中的证明[23]。但是,增强了收缩响应endothelium-intact动脉Panx1−−/与WT小鼠也观察到在应用甲氧苄胺(附加文件2:图S2),激活α1-肾上腺素受体,但不被交感神经占据[24]。当非受体激活高k引起收缩反应时,观察到类似的增强+去极化(图1C).这表明Panx1的抗收缩作用并不局限于α1-肾上腺素能激动剂,可能出现在对各种刺激的反应。

通过比较乙酰胆碱诱导的舒张作用,获得了Panx1在内皮中的功能作用的另一个强有力的证据endothelium-intactwt和panx1中的动脉−−/老鼠。乙酰胆碱仅通过内皮细胞上的受体影响动脉张力,因此内皮剥去的动脉不会因乙酰胆碱而扩张(数据未显示)。我们发现Panx1对乙酰胆碱的反应明显较弱−−/与wt隐差动脉(图1D),表明Panx1参与了内皮依赖的扩张机制的调节。

血管内皮中有三种推测的panx1介导的通路值得进一步探索:如前所述,panx1形成的缝隙连接通道相互连接内皮细胞[5或通过Panx1半通道介导的Ca2 +-流入和/或ATP释放[25,26]。细胞外ATP可以通过内皮P2受体诱导自身松弛[3.]或通过异蛋白酶降解到腺苷,有效的血管扩张剂[3.,27]。我们发现Panx1中内皮依赖性舒张减少和内皮的抗收缩作用−−/小鼠建议PanX1在这些机制中的参与。

总之,我们的数据首次证明Panx1参与了导管动脉内皮依赖性舒张的调节。我们发现Panx1介导肾上腺素能诱导的收缩的内皮作用,从而调节血管张力。本研究结果提示,导管动脉内皮细胞Panx1的活性对控制不同器官的血供具有重要意义。在血流增加的机械刺激(剪切应力)期间,导管动脉内皮的激活确保了它们的扩张,从而稳定了血管床近端部位的压降[28]。因此,Panx1在内皮中的阻断或消融可能会干扰血管近、远端阻力的适当调节,这是充分控制局部血流和维持动脉血压水平的必要条件。

方法

动物

Panx1−−/先前描述了小鼠菌株[29]。本研究中的所有实验都是全面遵守NIH指南,以便进行实验动物和俄罗斯国家动物研究指南。该议定书由迈阿密IACUC大学批准(协议#12-051)和俄罗斯科学院IACUC学院信息传输问题研究所(协议#02-2013)。野生型(WT)动物的年龄匹配(2-3个月大)C57BL / 6背景的雄性小鼠。小鼠在温度和湿度的标准条件下,具有12小时的光/暗循环,并免费获得食物和水。平均体重:WT - 28.9±0.6g,Panx1−−/- 26.2±0.4 g (p < 0.05)。

这些实验是通过隐动脉的制备来完成的,隐动脉在膝关节水平上从股动脉分支出来,为足供血[30.]。WT和Panx1隐动脉内径−−/小鼠分别为272.4±5.5微米,分别为304.9±5.8微米。对于力记录,2毫米环制剂安装在等距映射中[31.](详情见附加文件3.)。标准方法用于基因表达和统计分析(参见附加文件3.)。

评论家的评论

裁判1 -阿曼·穆尔基贾尼安博士

“伟德app苹果版生物学直接”旨在对生物学家的广泛观众,因此应该修改稿件,以在更广泛的生物学环境中培养作者的发现。因此,应扩展介绍和讨论部分。

作者的反应

尊敬的审稿人,非常感谢您对我们稿件的审阅。我们扩展了Introduction部分(在Discovery注释的文本大小限制范围内),以便面向更广泛的读者。此外,我们补充了关于Panx1缺陷的功能后果的短语讨论。

裁判2 -亚历山大·洛科夫斯基博士

本文介绍了Panx1敲除小鼠和/或内皮剥除小鼠血管中几种刺激对哺乳动物(小鼠)动脉收缩反应的测量。Panx1参与内皮依赖性血管舒张调控的结论得到了充分的支持和论证。方法(在实验室和数据分析)清楚地说明,每当声称统计意义,适当的p值计算。

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致谢

这项研究得到了俄罗斯基础研究基金会(资助号:13-04-02087)和美国国立卫生研究院(资助号:EY021517)的支持。作者承认M.V. Lomonosov莫斯科国立大学发展计划和俄罗斯联邦特别计划的部分支持[拨款号2012-1.5-12-000-1002-018]。

作者信息

从属关系

作者

相应的作者

对应到DINA GAYNULLINA.

额外的信息

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

OST和YP策划了该项目;DG、OST、OOK、VIS和YP进行实验、数据评估、解释和稿件准备。VIS生成小鼠模型。所有作者阅读并批准最终稿件。

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引用这篇文章

Gaynullina, D, Tarasova, os, Kiryukhina, o。o等等。帕南蛋白1敲除小鼠的导管损害内皮功能。杂志直接9日,8(2014)。https://doi.org/10.1186/1745-6150-9-8

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关键词

  • Pannexin1
  • 内皮
  • 隐动脉
  • 基因敲除小鼠
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